2.4 取材与处理

2.4 取材与处理

2.4.1 血分析

灌药后20、40天后，分别从小鼠尾静脉采血（采血前禁食不禁水12小时）20μl/只，放入有20μl抗凝剂的试管中混匀，送检验科行血常规检测。

2.4.2 骨髓有核细胞（BMNC）提取

参照唐佩弦方法[25]。

2.4.2.1 0.4%台盼蓝染液配制

台盼蓝0.4g，加双蒸水至100ml。

2.4.2.2 程序

灌胃40天后，颈椎脱臼法处死小鼠，75%酒精浸泡3min后，将小鼠置于无菌吸水纸上，腹面朝上，在小鼠股骨下端皮肤剪开一个小口，撕开皮肤，充分暴露股骨及胫骨（取双侧股骨），用镊子夹住胫骨，用眼科剪沿股骨尽量分离肌肉，在膝关节处剪开股骨与胫骨，用镊子提起股骨，在股骨大转子关节处剪下股骨，放入培养皿中，进一步清除股骨上肌肉组织，鼠齿镊夹住左侧股骨（右侧待用）剪去骨，用20号针头刺穿骨末端，用装有2ml注射器吸取RPMI-1640培养液向骨髓腔内快速推入，冲洗出骨髓细胞，收集在灭菌离心管内，用注射器反复推拉骨髓细胞悬液几次，使骨髓细胞充分分散，制成悬液。将骨髓细胞悬液1000r/min离心去除上清及脂肪层，用RPMI-1640培养液按1:1重新悬浮骨髓细胞，缓慢铺到离心管中预先加好的等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的表面上，离心3000r/20min，吸取中间云雾状单个核细胞层悬浮于20ml RPMI-1640培养液中，离心3000r/10min，弃去上清液，将沉淀细胞加入适量RPMI-1640培养液充分混匀制成细胞悬液，取0.5ml加入试管中，加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色2~3min，吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片，镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，死细胞能被台盼蓝染上色[26-28]，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。经台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上可以进行有核细胞计数。

裴正学系列方药的研究

2.4.3 股骨病理切片的制备