免疫组化染色步骤 40

免疫组化染色步骤[40]

2.4.1 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS液（pH7.5±0.1）冲洗3次，每次3min。

2.4.2 根据单克隆抗体的要求，加1ml EDTA修复液（pH8.0），对组织抗原进行修复。

2.4.3 每张切片加一滴过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS液冲洗三次，每次3min。

2.4.4 除去PBS液，每张切片加1滴正常非免疫动物血清，室温下孵育10min。

2.4.5 除去动物血清，每张切片加第一抗体，室温下孵育60min。

2.4.6 PBS液冲洗三次，每次5min，除去PBS液，每张切片加1滴生物素标记的第二抗体KT-9707-c，Biotin-conjugated second Antibody（Rabbit），室温下孵育10min，PBS液冲洗三次，每次3min。

2.4.7 除去PBS液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min，PBS冲洗三次，每次3min。

2.4.8 除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，镜下观察3～10分钟。

2.4.9 自来水冲洗，苏木素复染，PBS液冲洗返蓝。

2.4.10 DAB显色，所有切片经过梯度酒精逐级脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

过氧化物酶-抗过氧化物酶法，最终反应产物呈棕色，切片经图像分析软件处理后，根据平均光密度值及目标面积比得出阳性细胞所占百分数。

表4 裴氏升血颗粒对再障小鼠T淋巴细胞亚群含量的影响（x̄±S）

注：与模型组比较 #p<0.05 *p<0.01；与正常组比较 △p<0.05，○p<0.01

---

图8 裴氏升血颗粒对再障小鼠T淋巴细胞亚群的影响

如图8所示，再障模型组小鼠与正常组比较CD4值明显下降，CD8值明显升高，CD4/CD8比值降低。用药40d后，裴氏升血颗粒中、小剂量组CD4值明显升高，CD8值则明显降低，而大剂量组、贞芪组对CD4升高、CD8降低作用不显著，CD4/CD8值仅略升高，与模型组比较无显著性差异。

分析： 大量研究表明，再障患者存在T淋巴细胞亚群失衡，CD8细胞异常激活，导致抑制性细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等分泌异常增多[41]，协同对造血起负调控作用，导致造血干和（或）祖细胞增殖、分化缺陷[42]。裴氏升血颗粒作用环节可能是多方位的，一方面能调节机体紊乱的免疫功能，提高CD4、CD4/CD8比值，降低CD8的数量和活性，从而减少IL-2、IFN-γ等造血负调控因子的释放以解除对骨髓造血的抑制[43]。IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子不仅能直接抑制造血细胞的增殖[44]，而且还可通过Fas抗原（CD95）介导的细胞凋亡，诱导CD34细胞的程序性死亡，从而导致造血衰竭[45]，此外，能对造血干/祖细胞的增殖和分化具有直接的促进作用，尤其对红系造血。免疫组化法检测CD4、CD8，再障患者CD4、CD8处于早期激活状态[46]。以上试剂盒购自长沙赢润生物制品有限公司，批号为：GT200310，均按照试剂盒说明要求操作。

3 统计学处理

实验结果应用统计学软件SPSS10.0进行数据统计，所有实验数据均以均数±标准差（x̄±s）表示。两组计量资料采用Student's t检验，多组间计量资料采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以p<0.05为有显著统计学意义。

讨论

裴氏升血颗粒是全国著名中西医结合专家、导师裴正学教授集多年临床经验自行研制的抗肿瘤、提高机体免疫力的验方之一，具有补肾生髓、健脾益气、养血和胃等功效的纯中药颗粒冲剂。该药方的临床应用研究于2002年作为甘肃省科研课题，并完成了科技成果鉴定。[38]

裴正学系列方药的研究

该成果2003年被评为甘肃省中医药皇甫谧科技成果一等奖。该方曾因治愈白血病多例于1973年被全国血液学会议命名为兰州方，临床应用已有30多年。1997年作为甘肃省医学科学研究院院内制剂研制成"裴氏升血颗粒"。多年来的临床实践证明该方对免疫系统功能低下、恶性肿瘤，尤其对恶性肿瘤患者放疗、化疗后引起的免疫功能低下具有显著的临床疗效，截至目前已为省内外数万名患者进行了治疗，其临床疗效得到了临床医生和患者的认可，在省内外享有一定的知名度。

1 指标选择