2.5 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中突变型p53的表达

2.5 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中突变型p53的表达

2.5.1 制作石蜡切片

切片： 将石蜡包埋组织用病理切片机切成厚5μm石蜡切片。

脱蜡、水化： 脱蜡前，将切片在45℃恒温箱中烘烤120min。切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min，先后在无水乙醇中浸泡5min，95%乙醇中浸泡5min，70%乙醇中浸泡5min。

2.5.2 免疫组织化学染色(SP法)

• PBS洗2~3次各5min
• 滴加3%H₂O₂消除内源性过氧化物酶的活性，室温静置10min
• PBS洗2~3次各5min
• 抗原修复： 水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至92℃~95℃左右，放入切片加热15min。自然冷却。
• 滴加正常山羊血清封闭液，室温15min。甩去多余液体
• 滴加Ⅰ抗(兔抗人P53单克隆抗体)，37℃孵育2.5h
• PBS冲洗，3min×3次
• 滴加生物素二抗工作液，37℃孵育15min
• PBS冲洗，3min×3次
• 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min
• PBS冲洗，3min×3次
• DAB显色： 1ml蒸馏水+ABC三种液体各一滴(用前现配)，显色5~10min，在显微镜下掌握染色程度
• PBS冲洗10min
• 苏木精复染
• 自来水冲洗中止反应
• 逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片

2.5.3 p53阳性判断标准

突变型p53蛋白阳性反应产物主要位于细胞核，细胞核染成棕黄色、棕褐色为突变型P53阳性反应，否则为阴性。分别随机观察10个高倍镜视野，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为p53的阳性细胞数。