2 实验方法

2.1 模型制备

从H22瘤株传代小鼠的腹腔抽取乳白色的瘤液，参照文献[11]，用生理盐水稀释至瘤细胞计数为2×10⁷个/ml[12]，除正常组12只外，在其余每鼠右前腋部皮下接种瘤液0.2ml。

2.2 动物分组及剂量

接种24h后，将动物随机分为裴氏升血颗粒（PG）高剂量（10g·kg⁻¹，相当于成人用量的

裴正学系列方药的研究

20倍)+5-Fu组、中剂量(5g·kg⁻¹，10倍)+5-Fu组、低剂量(2.5g·kg⁻¹，5倍)+5-Fu组、5-Fu(0.02g·kg⁻¹)对照组、模型对照组，每组各12只。裴氏升血颗粒临用前用蒸馏水充分溶解，给予等容积(0.2ml/10g)经灌胃给药[13]，每日一次；5-Fu剂量均为0.02g·kg⁻¹，经腹腔注射给药，每日一次；正常组和模型组给予等量蒸馏水，每日一次，连续给药10d[2]。

2.3 抑瘤率的测定

停药次日称重，处死小鼠，剖取肿瘤组织，称重，按公式计算抑瘤率：

抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

2.4 血常规的检测

用75%的酒精棉球消毒小鼠尾部，尾静脉采外周血20μl，加血细胞稀释液0.5ml混匀，血细胞自动分析仪检测。

2.5 小鼠骨髓DNA含量的检测

采完血后，将各组小鼠处死，取小鼠右侧完整股骨一根，剔除外部肌肉组织，用0.05mol/L CaCl₂溶液10ml将全部骨髓冲入离心管中，4℃冷藏30min后，以2500转/分离心15min后，弃上清液，将沉淀物加入0.2mol/L HClO₄ 5ml充分混合，水浴加热15min，冷却，以1000转/分离心5min，用紫外分光仪于268nm处测OD值。

2.6 放免法测定血清TNF-α的浓度

摘除小鼠眼球采血，用干净试管收集血液，室温凝固2小时，离心1500转10min，收集血清分装后-20℃冷冻保存。依¹²⁵I-TNF-α放射免疫药盒说明书，将药盒中提供的校准品依次加入试管中，标记物、抗体等试剂按程序规定分别加入对应的试管中，充分混匀，放置于4℃冰箱中24h后，加入PR分离剂，充分混匀，室温放置20min，离心前任取两管测量总放射性T，4℃ 3500转离心25min，弃上清液，在γ计数器上测量各管放射性计数。在logit-log坐标纸上绘制标准曲线，根据样品B/B₀%，从标准曲线上查出样品的浓度。

2.7 ELISA法测定血清IFN-γ的浓度

摘除小鼠眼球采血，用干净试管收集血液，室温凝固2h，离心1500转10min，收集血清封装，-20℃冷冻保存。IFN-γ浓度测定：按试剂盒说明操作。

试剂的配制： ① 提前30min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温。 ② 标准品的稀释：将冻干品管内加入1ml样品稀释液，彻底溶解后做倍比稀释。 ③ 生物素标记抗体工作液：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl生物素标记抗体加抗体稀释液990μl的比例配制。 ④ 亲和素-过氧化酶复合物(ABC)工作液的准备：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl亲和素-过氧化酶复合物(ABC)加ABC稀释液990μl的比例配制。

操作步骤： ① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。 ② 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，一孔只加样品稀释液作为对照，处理后的标本100μl每孔加入。 ③ 用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。 ④ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗板2次。 ⑤ 将准备好的生物抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。用封板胶封住反应孔，37℃反应60min。 ⑥ 0.01M TBS洗涤3次，每次浸泡1min左右。 ⑦ 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。用封板胶封住反应孔，37℃反应30min。 ⑧ 0.01M TBS洗涤5次，每次浸泡12min左右。 ⑨ 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见标准品的前34孔有明显梯度蓝色，后3~4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔。（显色反应最长不要超过30min）。用酶标仪在450nm测定OD值，根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

2.8 统计学方法

所有实验数据以均数±标准差(x̄±s)表示，应用SPSS16.0统计学软件进行数据统计，多组均数采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

3 试验结果

3.1 一般情况

小鼠接种瘤细胞后的前三天内，在外观上与正常组无明显差异，饮食量正常，运动活泼，被毛光泽。接种后第五天开始，模型组运动迟缓，右前肢腋部皮下可触及扁平包块，表面凹凸不平，可见多个结节；5-Fu组及裴氏升血颗粒联合5-Fu各组包块摸之较小，但精神较前两组为佳。一周后，模型组饮食减少，包块增大，运动缓慢，被毛无光泽，竖毛现象明显，反应迟钝，喜群聚。5-Fu组状态明显不及模型组和正常组，毛无光泽而稀疏脱落，少动，喜群聚，懒于觅食，且诸状态逐日加重。裴氏升血颗粒联合5-Fu各组，一般情况尚可，被毛尚光泽，无脱毛现象，仍喜活动，饮食正常。

3.2 裴氏升血颗粒联合5-Fu对荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响

由表1可以看出，各治疗组的瘤重均低于模型组，统计学有显著性差异(p<0.05)；PG低、中、高剂量联合5-Fu组瘤重均低于5-Fu组，其中中剂量组与5-Fu组相比，统计学有显著性差异(p<0.05)。PG低、中、高剂量联合5-Fu组、5-Fu组抑瘤率分别为：51.17%、61.07%、56.03%、47.93%。详见表1、图1。

表1 裴氏升血颗粒对小鼠瘤重及抑瘤率的影响(n=10，x̄±s)

注：*p<0.05与模型组比较，△p<0.05与5-Fu组比较

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