2.6 ELISA法测定血清EGF的浓度

2.6 ELISA法测定血清EGF的浓度

摘除小鼠眼球取血，用干净试管收集血液，室温凝固2h，离心（1500rpm）10min后，收集血清于Eppendorf管封装，-20°C冷冻保存。

EGF的浓度测定：按试剂盒说明操作。

试剂的配置：

① 提前30min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温；

② 标准品的稀释：将冻干品管内加入1ml样品稀释液，彻底融化后做倍比稀释；

③ 生物素标记抗体工作液：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl生物素标记抗体加抗体稀释液990μl的比例配制；

④ 亲和素-过氧化酶复合物（ABC）工作液的准备：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl亲和素-过氧化酶复合物（ABC）加ABC稀释液990μl的比例配制。

操作步骤：

① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条；

② 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，一孔只加样品稀释液作为对照，处理后的标本100μl每孔加入；

③ 用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟；

④ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗板2次；

⑤ 将准备好的生物抗体工作液按每孔0.1ml依次加入，用封板胶封住反应孔，37℃反应60min；

⑥ 0.01M TBS洗涤3次，每次浸泡1min左右；

⑦ 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，用封板胶封住反应孔，37℃反应60min；

⑧ 0.01M TBS洗涤5次，每次浸泡2min左右；

⑨ 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应，反应过程中，要经常观察。当肉眼可见标准品的前34孔有明显梯度蓝色，后34孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔（显色

裴正学系列方药的研究

反应最长不要超过30min）。用酶标仪在450nm测定OD值，根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

2.7 放射免疫法测定血清IL-1的浓度

摘除小鼠眼球取血，用干净试管收集血液，室温凝固2h，离心（1500r/min）10min后，收集血清于Doff管封装，-20℃冷冻保存。本实验采用平衡法，取聚丙乙烯试管编号，具体步骤根据放免药盒说明书按下表操作：

IL-1β RIA加液程序（单位：μL）

充分混匀，4℃温育16h

免疫分离剂 500 500 500 500

充分混匀，室温放置20min后，4℃ 3500rpm离心25min，吸弃上清液，在γ计数器上测定cpm数，采用预先编辑的程序得出样品IL-1β浓度。

2.8 统计学方法

所有实验数据以均数±标准差（x̄±s）表示，应用SPSS17.0统计学软件进行数据统计，多组均数采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。取p<0.05作为有统计学意义。

3 实验结果