2.6 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中VEGF、p53的表达

2.6 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中VEGF、p53的表达

实验结束后将取出的肿瘤组织，用10%甲醛固定，脱水，用石蜡包埋。

2.6.1 制作石蜡切片

切片：将石蜡包埋的组织用病理切片机切成厚5μm石蜡切片。

脱蜡、水化：脱蜡前，将切片在45℃恒温箱中烘烤60min。切片置于二甲苯中浸泡20min，更换二甲苯后再浸泡20min，先后在无水乙醇中浸泡10min、95%乙醇中浸泡10min、90%乙醇中浸泡10min、85%乙醇中浸泡10min。

2.6.2 免疫组织化学染色(SABC法)

• PBS洗2~3次各5min
• 滴加3%H₂O₂室温静置孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性
• PBS洗2~3次各5min
• 抗原修复：水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(PH6.0)至92℃95℃左右，放入切片煮15分钟。自然冷却2030min
• PBS(PH7.2~7.6)冲洗，3min×3次
• 滴加正常山羊血清封闭液，室温15min，甩去多余液体，不洗
• 分别滴加一抗(兔抗鼠VEGF单克隆抗体、兔抗鼠P53单克隆抗体)，37℃孵育2h左右
• PBS(PH7.2~7.6)冲洗，3min×3次
• 分别滴加生物素二抗工作液，37℃孵育15min
• PBS冲洗，3min×3次
• 分别滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min
• PBS冲洗，3min×3次
• DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5~30min之间。蒸馏水洗涤
• 苏木精轻度复染
• 自来水冲洗中止反应
• 逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片
• 显微镜观察

2.6.3 免疫组化指标检测

P53阳性反应产物主要位于细胞核，细胞核被染成棕黄色、棕褐色为P53阳性表达；VEGF阳性反应产物主要位于细胞质，细胞质染成棕黄色、棕褐色为VEGF阳性表达。400倍光镜视野下，每组随机取5个标本的切片，每张切片随机采3个视野，每组共计15个视野，采集图像，并以BI-2000医学图像分析软件进行半定量检测VEGF、P53染色阳性物质的平均光密度(MOD)，分别表示VEGF和P53的含量。