1 材料与方法

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物

裴氏升血颗粒：人参须、北沙参、太子参、潞党参等组成，由甘肃省医学科学研究院提供，每包含生药36.25g。

贞芪扶正颗粒：由定西制药厂提供，批号003021。

1.1.2 实验动物

BALB/C小鼠，雌雄各半，体重22±2g，清洁级，由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第14-009。

1.1.3 瘤株

小鼠移植性肝癌（H₂₂）瘤株，北京药物所引进，甘肃省医学科学研究院药理毒理中心保种。

1.1.4 实验试剂

1.1.5 实验仪器

1.2 实验方法

1.2.1 瘤种接种

H₂₂肿瘤接种按《全国抗癌药物筛选规程》进行。在无菌操作条件下，取荷肝癌（H₂₂）小鼠腹水，用0.9%生理盐水稀释至含瘤细胞2×10⁷个/ml，每鼠右腋皮下接种0.2ml。

1.2.2 剂量设计与分组

裴氏升血颗粒临床成人剂量30g/d，即为0.5g·kg⁻¹，根据文献中人/小鼠用药等效剂量换算法设计不同剂量组：

• 裴氏升血颗粒小剂量组：2.5g·kg⁻¹（相当于成人用量的5倍）
• 裴氏升血颗粒中剂量组：5g·kg⁻¹（相当于成人用量的10倍）
• 裴氏升血颗粒大剂量组：10g·kg⁻¹（相当于成人用量的20倍）

同时设：

• 模型组
• 贞芪对照组：1.67g·kg⁻¹（相当于成人用量的10倍）
• 正常对照组

每组各10只动物。

1.2.3 给药方法

小鼠接种次日开始给药，实验组灌胃给予0.2ml/10g体重的药物，正常组及模型组给予等容量蒸馏水，每日1次，连续给药15d。

1.2.4 肿瘤抑瘤率测定[4]

停药次日，断颈处死小鼠，完整剥离肿瘤，用电子天平称瘤重。

计算肿瘤抑瘤率：

瘤重抑制率(%) = (1 - T/C) × 100%

（T/C：治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）

1.2.5 巨噬细胞吞噬功能测定

按照文献[5]制备腹腔巨噬细胞：钝性剥离腹部皮肤，每鼠腹腔内注射10ml PBS液，收集腹腔巨噬细胞，转移于10ml离心管中离心（4℃，1000rpm，5min），弃上清，用1640培养液调细胞浓度2×10⁶/ml，在96孔细胞培养板上每孔加入200μl细胞悬液（每个标本设2个复孔），37℃ 5% CO₂培养箱孵育2h。甩去培养液，加入100μl 0.072%的中性红，37℃ 5% CO₂培养箱孵育30min，弃去中性红，用温PBS液洗3次，每孔再加入0.1mol/L的酸性异丙醇150μl，充分混匀。静置过夜，次日用酶标仪测定A值。

1.2.6 NO诱生及检测

取上述制备的腹腔巨噬细胞，加入96孔培养板，200μl/孔，37℃ 5% CO₂培养箱孵育2h后，弃去培养液，PBS洗去未贴壁细胞，加入50μg/ml的LPS液200μl/孔，37℃ 5% CO₂培养箱孵育24h，上清即为NO待测样品。将待测样品加入96孔培养板，100μl/孔，每个标本设4个复孔，2孔为空白孔，2孔加Griess液100μl/孔，室温放置10min，酶标仪测A值。

1.2.7 IL-1的诱生及检测[6]

取上述制备的腹腔巨噬细胞，加入48孔培养板中，每孔1ml，37℃ 5% CO₂培养箱孵育2h后，弃去培养液，PBS洗去未贴壁细胞，加入5μg/ml的LPS液1ml/孔，37℃ 5% CO₂培养箱孵育24h，收集上清为待测IL-1样品。

按试剂盒说明操作：

试剂的配制： ① 提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温。 ② 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:20）。 ③ 标准品：加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置15min混匀（2000pg/ml），根据标准曲线所需浓度再作稀释。（标准曲线浓度为：7.8、15.625、31.25、62.5、125、250pg/ml） ④ 生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1:100）。 ⑤ 酶结合物工作液：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物（1:100）。

操作步骤： ① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板

裴正学系列方药的研究

1.2.7 脾细胞IFN-γ的诱生及检测

无菌取脾，放入PBS液中涮洗一次，用载玻片轻轻捻碎，吸取3ml PBS液冲洗载玻片及平皿，用滤网(200目)过滤至小青瓶中，再将其沿管壁缓缓转入预先装入3ml淋巴细胞分离液的10ml玻璃离心管中，离心(4℃ 3000rpm，20min)，用吸管吸取淋巴细胞分离层至5ml玻璃离心管中，加PBS液至5ml刻度线，离心(4℃ 1000rpm，10min)，弃上清，用1640液调细胞浓度至1×10⁶/ml，加入48孔培养板中，每孔1ml，同时加入终浓度为5μg/ml的LPS，37℃ 5%CO₂培养箱孵育24h，收集上清为IFN-γ待测样品。

按试剂盒说明操作：

试剂的配制： ① 提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温。 ② 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:20）。 ③ 标准品：加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置15min混匀(2000pg/ml)，根据标准曲线所需浓度再作稀释。（标准曲线浓度为：7.8、15.625、31.25、62.5、125、250pg/ml） ④ 生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1:100）。 ⑤ 酶结合物工作液：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物（1:100）。

操作步骤： ① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。 ② 除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。 ③ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在后续吸水纸上拍干。洗板5次。 ④ 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。 ⑤ 洗板5次。 ⑥ 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育30min。 ⑦ 洗板5次。 ⑧ 加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育15~20min。 ⑨ 加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5min内)。

1.2.8 脾细胞IFN-γ的诱生及检测

无菌取脾，放入PBS液中涮洗一次，用载玻片轻轻捻碎，吸取3ml PBS液冲洗载玻片及平皿，用滤网(200目)过滤至小青瓶中，再将其沿管壁缓缓转入预先装入3ml淋巴细胞分离液的10ml玻璃离心管中，离心(4℃ 3000rpm，20min)，用吸管吸取淋巴细胞分离层至5ml玻璃离心管中，加PBS液至5ml刻度线，离心(4℃ 1000rpm，10min)，弃上清，用1640液调细胞浓度至1×10⁶/ml，加入48孔培养板中，每孔1ml，同时加入终浓度为5μg/ml的LPS，37℃ 5%CO₂培养箱孵育24h，收集上清为IFN-γ待测样品。

按试剂盒说明操作：

试剂的配制： ① 提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温。 ② 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:20）。 ③ 标准品：加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置15min混匀(2000pg/ml)，根据标准曲线所需浓度再作稀释。（标准曲线浓度为：7.8、15.625、31.25、62.5、125、250pg/ml） ④ 生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1:100）。 ⑤ 酶结合物工作液：以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物（1:100）。

操作步骤： ① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。 ② 除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。 ③ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在后续吸水纸上拍干。洗板5次。 ④ 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。 ⑤ 洗板5次。 ⑥ 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育30min。 ⑦ 洗板5次。 ⑧ 加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育15~20min。 ⑨ 加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5min内)。

1.2.9 2、4二硝基氯苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）

试验分组及给药方法同前。处死前5d每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm，用1%DNCB溶液50μl均匀涂抹致敏。处死前一天用DNCB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用不锈钢铳子冲下直径8mm的左右耳片称重(mg)。用左右耳重量之差表示DTH的程度。

1.3 统计学处理

所有实验数据均以均数±标准差（x̄±s）表示，实验结果应用统计学软件SPSS10.0进行数据统计，多组均数用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

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2. 结果