附图

附图

88页 突变型P53免疫组化照片 (免疫组化染色，×400)

• A 模型组
• B PG低剂量组
• C PG中剂量组
• D PG高剂量组
• E ZG组

89页 肿瘤病理组织照片 (HE染色，×400)

• A 模型组
• B PG低剂量组
• C PG中剂量组
• D PG高剂量组
• E ZG组

90页 caspase-3流式细胞图

• A 模型组
• B PG低剂量组
• C PG中剂量组
• D PG高剂量组
• E ZG组

裴正学系列方药的研究

讨论

肿瘤（tumour）是机体在各种致瘤因素的作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去了对其生长的正常调控，导致细胞的异常增生而形成的新生物。肿瘤是基因疾病，其生物学基础是基因的异常。致瘤因素使体细胞基因突变导致正常基因异常，基因表达紊乱，从而影响细胞的生物活性，形成了与正常细胞在形态、代谢与功能上均有所不同的肿瘤细胞。两类基因直接参与肿瘤的发生，它们是癌基因（oncogene）和抑癌基因。癌基因的表达产物对细胞增殖起正调节，当它们发生突变或过度表达，可致细胞过度增生。反之抑癌基因的表达产物，则对细胞的增殖起抑制作用。[17][30]

研究表明，肝癌的发生、发展与多种凋亡相关基因有关。P53是一种肿瘤抑制基因，可以编码一种相对分子质量为53000的核磷酸蛋白，有野生型（Wt）和突变型（Mt）两种。而正常细胞中野生型p53蛋白的半衰期短，代谢不稳定及含量低，用常规免疫组化难以检出，故免疫组织化学检测的P53蛋白属于突变型P53蛋白。[18]P53基因作为抑癌基因，其编码的蛋白有抑制细胞DNA合成、阻止细胞由G期进入S期的作用。在肿瘤组织中，该基因发生突变成为突变型，所编码的蛋白失去抑癌作用。研究表明，P53基因的突变或失活是多种肿瘤发生发展过程中的重要事件。P53功能的丢失主要是由于基因突变，P53基因发生突变，丧失抑制细胞增殖分裂功能，则与ras、c-myc等癌基因协同使正常细胞发生转化——癌变。P53基因的突变存在明显的异质性，即表现为基因结构及转录、翻译等不同水平的突变。结构突变通常是碱基置换、移码突变、重排或基因缺失等，其中碱基置换（点突变）是P53基因主要的突变方式，其突变热点常集中于58外显子的数个密码点，有173、178、248、249、278等，碱基置换虽然只发生一、二个碱基，但因其主要在基因的功能区而使氨基酸组成发生变异，从而引起蛋白质功能的变化。在许多人类恶性肿瘤的P53基因进行检测中也已发现，98%以上的突变发生在外显子58内。因此，该区域的突变率可以基本反映P53基因的突变率。突变型P53蛋白在细胞内积聚则促进细胞的转变和增殖，导致肿瘤的发生。[18]通过药物控制突变型P53的发生是本实验的最终目的。本实验显示：裴氏升血颗粒各剂量组小鼠突变型P53蛋白的表达均低于模型组，以大、中剂量组作用最优（p<0.05）。表明：裴氏升血颗粒对小鼠H肿瘤有较明显的抑制作用，从而提高抗肿瘤效应。

Caspase是一组细胞凋亡蛋白酶，近年来人们发现Caspase-3在凋亡信号传导中起着核心作用，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的下游因子，它的活性受到抑制，就会引起细胞凋亡障碍，使细胞凋亡与增殖之间动态平衡失调，并可能进一步引起肿瘤的发生及发展。[19]Caspase-3在细胞凋亡中的作用：灭活阻止细胞凋亡的细胞内物质。通过对细胞结构的直接酶解而促进凋亡。通过对一些细胞骨架调节相关蛋白质的酶解而改变细胞结构，包括凝集素、FAK和由P21激活的激酶II（PAK2），因这些蛋白分解失活，而导致细胞凋亡。Caspase-3发挥作用的起点是其调节区与效应区的分离。Caspase-3参与细胞凋亡时具有回忆性，它能有计划执行每一步，切断与周围细胞的联系，重组细胞骨架，阻断DNA复制和修复等。[20]实验表明，Caspase-3前体广泛表达于各种细胞内，迅速有效地诱导细胞凋亡，且在神经细胞中存在的时间最长。复杂的蛋白水解系统常由起调节作用的激酶、辅助因子、反馈因子等有次序地共同调控效应型激酶的活性而组成。那如何启动细胞的凋亡呢？大量的基因分析和生化证据提出了Caspase-3的激活是一个级联模式，死亡信号激活了起始型Caspase-3，然后激活效应型Caspase促使细胞崩解。[21][22][23]然而，死亡受体和线粒体是先对死亡信号进行加工、整合，再激活不同的起始型Caspase-3的。研究表明Caspase-3在许多正常人体组织和肿瘤中表达。Caspase-3参与肝细胞增殖及转化细胞凋亡过程的调节，Caspase-3的低表达有助于HCC的发生，Caspase-3低表达对HCC发生、发展起着重要作用。本研究实验结果显示：裴氏升血颗粒能够促进Caspase-3蛋白的表达，通过上调Caspase-3蛋白的表达诱导细胞凋亡实现抗肿瘤的作用，促进肿瘤细胞发生凋亡从而发挥裴氏升血颗粒抗肿瘤的功能。

脾脏是重要的外周免疫器官之一，胸腺是重要的中枢免疫器官，在机体的免疫调节中发挥重要的作用；因此，观察胸腺和脾脏的改变，可以评价机体的免疫状态。[24]本实验表明裴氏升血颗粒能增强荷瘤小鼠非特异性免疫功能。

《内经》首先提出积聚的病名，并对其形成和治疗原则进行了探讨。肝癌属中医"积"之范畴，"积"者有形，固定不移，痛有定处，呈刺痛，病多在脏，属血分，且病程较长。[2]肝癌一病，早在《内经》就有类似记载；历代有肥气、痞气、积气之称。如《难经》载："脾之积，名曰痞气。在胃脘，腹大如盘，久不愈。令人四肢不及，发黄疸，饮食不为肌肤。"《素问玄机原病式》记："腹中坚硬，按之应手。"《诸病源候论·积聚候》载："诊得肝积，脉弦而细，两胁下痛。"[26]"记载了肝癌的诊断要点。祖国医学把肿瘤叫瘤瘕、积聚、瘿瘤、乳岩、失荣、脏毒、噎膈等，认为肿瘤的产生有内伤病因（正气亏虚和情志失调）和外源病因（外邪与饮食营养因素）两种，其病机主要为气滞血瘀、痰湿凝聚、热毒内陷、正气虚弱等。现代医学对肿瘤主要采取手术、放疗及化疗进行治疗，而中医根据辨证论治采用的治疗法则主要有扶正培本、清热解毒、活血化瘀、软坚散结、化痰祛湿及以毒攻毒。

祖国医学认为人类发病学方面，以"正气内虚"为致病之本。《素问》提出"正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚"。[27]《外科正宗》说："积之成者，正气之虚也，正气虚而后积成"，直接把《素问》"正虚发病"的观点应用于肿瘤之发病，只有正气不足的情况下，邪气才能侵犯人体，致气血阴阳失调，而形成肿瘤。[2]《灵枢·刺节真邪篇》说："真气者，所受于天，与谷气并而充其身也"，真气包含着先天与后天两个方面，历代医家把先天方面归于两肾，名曰"元气"（原气）；把后天方面归于脾胃，名曰"中气"（谷气）。脾主中气，肾主元气，因此在"扶正固本"法则中，"健脾"与"补肾"便是最重要的两端。实验研究证明，中医的"脾"、"肾"具有免疫系统、内分泌系统、代谢系统、植物神经系统、胃肠胰内分泌系统等诸方面的意义，"健脾补肾"具有改善上述各方面功能的作用。"扶正固本"这一旨在发挥和动员人体抗病能力的观点和现代免疫

裴正学系列方药的研究

学、分子生物学之间存在着很大的共同性。肝癌患者早中晚期都可有正虚的表现，常出现神倦乏力，头昏腰酸、心悸气短等症状。此类药能补充人体气血阴阳之不足，改善症状、减轻放化疗毒副反应，保护脾胃、保护骨髓，并通过扶正培本提高机体免疫功能而有效地抑制肿瘤的生长与发展，从而延长患者的生命。现代研究表明，扶正培本药用以治疗肿瘤有以下作用：①能促进机体免疫功能，提高淋巴细胞增殖和网状内皮系统活力；②能保护和改善骨髓造血功能，提高血液细胞成分；③能提高内分泌体液的调节功能，促进垂体-肾上腺皮质功能；④能调整患癌机体内环腺苷酸和环鸟苷酸的比值，有利于抑制癌细胞的生长；⑤有双相调节作用；⑥能提高机体物质代谢；⑦能减轻放化疗毒副作用，增强放化疗的效果；⑧某些扶正方药有直接抑癌、控制癌细胞浸润和转移的作用。常用药物有：党参、太子参、黄芪、黄精、女贞子、巴戟天、仙茅、白芍、地黄、杜仲、补骨脂、鳖甲、菟丝子、甘草等。在肿瘤的药物治疗方面，主要是化学治疗、免疫治疗、生物治疗、中药治疗等多种方法的综合治疗表现出增效减毒效果，使患者肿瘤缓解率、生存质量及生存期延长率大大提高，但目前肿瘤治疗也存在着多药耐药现象、化疗的严重毒副作用，免疫和骨髓造血功能的破坏等问题，使肿瘤的治疗面临严重困难。因此，寻找安全、有效的药物是目前肿瘤研究的重要课题。现代研究表明，中药治疗肿瘤可以通过提高机体免疫力、诱导肿瘤细胞分化和凋亡，影响肿瘤细胞周期，抑制肿瘤血管生成，抗肿瘤转移及逆转化疗药物多药耐药等方面发挥抗肿瘤作用，尤其在增效减毒方面具有整体治疗的优势。

导师裴正学教授，结合自己四十多年的临床经验，认为"正虚"是恶性肿瘤发生、发展的根本原因；扶正固本是治疗恶性肿瘤的基本法则，在应用这一法则时以"健脾补肾"为其精髓；由此拟定"兰州方"，经40余年的不断实践、充实、重组，最后制成"裴氏升血颗粒"，其组成主要有：六味地黄汤、生脉散、北沙参、党参、太子参、桂枝、大枣、五味子、炙甘草、白芍等。"四参"集健脾益气之大成，为补益后天之本之劲旅，合生脉散益气补肺使四参健脾益气之功益彰；"六味地黄汤"为补益肾气之专方，重用山萸肉（30g）使补益先天之功益彰；"桂枝汤"：桂枝、白芍、生姜、甘草、大枣为完整之桂枝汤组成，此方"外合营卫，内安脏腑"，前人称之为群方之冠。裴老认为："兰州方"中之桂枝汤在大补先天与后天之同时，加强了调和营卫、内安脏腑之功，实则加强了植物神经系统、代谢系统、内分泌系统、免疫系统之调节作用。浮小麦、甘草、大枣为甘麦大枣汤，古人用此方治疗妇女精神抑郁症疗效确切。裴老认为：兰州方中之甘麦大枣除了具有调节植物神经系统作用外，尚有安神镇静、调节思维之作用，补充了上述主要未尽之功。综上所述，"兰州方"以扶正固本之大法加强了人体正气，从而达到扶正祛邪的作用，在临床上还要根据患者具体情况辨证论治、加减进退才能取得预期疗效。

总之，本实验通过建立荷瘤（H）小鼠模型，借助分子生物学技术，进一步观察裴氏升血颗粒诱导肿瘤细胞凋亡的机制，及其对凋亡相关基因p53和Caspase-3的蛋白表达情况，进一步深入的研究和探讨，为该药在治疗恶性肿瘤方面的应用，以及为中医和中西医结合治疗肿瘤提供科学依据，为裴氏升血颗粒临床广泛应用提供科学、微观的依据。

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裴正学系列方药的研究

结语