裴氏升血颗粒合用5-Fu对小鼠移植性肿瘤H₂细胞凋亡及P27蛋白表达的影响

裴氏升血颗粒合用5-Fu对小鼠移植性肿瘤H₂细胞凋亡及P27蛋白表达的影响

丁洁霞

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中文摘要

目的： 探讨裴氏升血颗粒（PG）对H₂荷瘤小鼠化疗的增效减毒作用及对肿瘤组织中P27蛋白表达和肿瘤细胞凋亡率的影响。

方法： 建立H₂荷瘤小鼠模型，通过计算抑瘤率来分析5-Fu的体内抗肿瘤活性，判断PG的增效作用；通过测定胸腺指数和脾脏指数，判断PG对5-Fu化疗小鼠的减毒作用。采用免疫组化法测定H₂肿瘤组织中P27蛋白的表达，用流式细胞术测定H₂肿瘤细胞周期及细胞凋亡率。

结果： ① 5-Fu的抑瘤率为42.47%，PG与5-Fu合用抗肿瘤有相加作用，其中高、中剂量PG与5-Fu合用抑瘤作用显著，其抑瘤率为62.66%、59.30%；

② PG可减轻荷瘤小鼠由5-Fu引起的免疫器官的抑制，使胸腺指数和脾脏指数明显改善；

③ 肿瘤组织中P27蛋白的表达各治疗组与模型组比较有显著性差异（P<0.05），PG可上调P27蛋白的表达。

④ 模型组肿瘤细胞G₀/G₁期比例最低，S期比例最高。用药各组的肿瘤细胞G₀/G₁期比例明显上升，其中以高、中剂量PG+5-Fu组上升最为明显，与模型组及5-Fu组比较有显著性差异（P<0.05）；用药各组的肿瘤细胞S期比例均下降，其中以高剂量PG+5-Fu组下降最为明显，与模型组及5-Fu组比较有显著性差异（P<0.05）；

⑤ 各剂量PG合用5-Fu组肿瘤细胞凋亡率上升，其中以高、中剂量PG+5-Fu组肿瘤细胞凋亡率上升最为明显，与5-Fu组比较有显著性差异（P<0.05）。

结论： PG对5-Fu化疗的荷瘤小鼠具有明显的增效减毒作用，可以上调肿瘤组织中P27蛋白的表达，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而起到抗肿瘤的作用。

关键词： 裴氏升血颗粒（PG）；增效；减毒；细胞周期；细胞凋亡；P27蛋白

裴正学系列方药的研究

ABSTRACT

Objective: Research the efficacy enhancing and toxicity reducing of PG in H22 tumor-bearing mice on chemotherapy and the affect of tumor tissues of P27 protein expression and tumor cell apoptosis rate.

Methods: To establish the model of H22 tumor-bearing mice. To analyse antitumor activity of 5-Fu in vivo and judge efficacy enhancing of PG by calculating inhibition rate. To judge PG toxicity reducing on 5-Fu by measuring the thymus index and spleen index. To observe the expression of P27 protein by immunohistochemical method, tumor cell cycle and apoptosis rate by flow cytometry.

Results: ① The inhibition rate of 5-Fu was 42.47%. PG and 5-Fu combination had additive anti-tumor effect. High and medium doses PG and 5-Fu combination had significant anti-tumor effect and their inhibition rates were 62.66% and 59.30%. ② PG reduced the tumor-bearing mice by 5-Fu-induced suppression of immune organs, and the thymus index and spleen index improved. ③ P27 protein expression in the treatment groups compared with the model group were significantly different (p<0.05) and PG could induce the expression of P27 protein value. ④ Model group, the lowest proportion of cells in G0/G1 phase and the highest proportion of S phase. Medication in each group increased in the proportion of cells in G0/G1 phase. High and medium doses of PG + 5-Fu groups increased most significantly and compared with the model group and 5-Fu group were significantly different (p<0.05). Medication in each group the proportion of cells in S phase reduced. High-dose PG + 5-Fu group reduced the most obvious and compared with the model group and 5-Fu group were significantly different (p<0.05). ⑤ Various doses of PG combination of 5-Fu groups increased apoptosis of tumor cells. High and medium doses of PG + 5-Fu groups increased the most obvious, compared with 5-Fu group were significantly different (p<0.05).

Conclusion: PG has obvious efficacy enhancing and toxicity reducing on tumor-bearing mice who are treated with 5-Fu. PG can induce the expression of P27 protein and apoptosis in tumor cells to show the antitumor function.

Keywords: PG; efficacy enhancing; toxicity reducing; cell cycle; apoptosis; P27 protein

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前言

裴氏升血颗粒是全国著名中西医结合专家导师裴正学教授，集40余年的临床经验，根据扶正固本的理论严密组方，拟定的治疗白血病专方。主要由六味地黄汤合生脉散加人参须、太子参、北沙参、党参等组成，重用人参须、太子参、党参、北沙参以健脾；六味地黄汤以补肾。

裴正学系列方药的研究

该方因在三十年前完全彻底治愈了急性单核细胞性白血病（M₂）患者马长生，在1974年苏州全国血液病会议上被定名为"兰州方"。此后裴教授用此方加减治疗各种血液病及以此方为主配合放化疗治疗肿瘤取得显著疗效。2003年，裴氏升血颗粒又成功治愈了一例白血病患者（L₂）刘力刚，先后在《南昌日报》及《甘肃日报》进行报道。裴教授用此方除了治疗白血病之外，对恶性肿瘤，尤其是配合放化疗治疗多种恶性肿瘤等方面取得显著疗效，与放化疗药物合用能起到增效和减毒的作用，提高机体免疫力和抗肿瘤的治疗效果，延长患者的生存期限、提高了患者的生活质量。1997年该方作为甘肃省医学科学研究院院内制剂，命名"裴氏升血颗粒"。该药剂之部分实验研究已通过了成果鉴定，曾获得甘肃省皇甫谧科技成果一等奖。鉴于裴氏升血颗粒具有显著的临床疗效，已成为省内外众所周知的血液病、肿瘤病之专剂。

在我跟师学习期间，据不完全统计该方治愈食道癌3例、胃癌1例、白血病3例、再生障碍性贫血3例、原发性肝癌3例。其中对食道癌、胃癌、肝癌、白血病、再生障碍性贫血等病之疗效显著。薛氏运用"兰州方"治疗原发性肝癌，使患者肿块明显缩小，肝功能完全恢复，提高了患者的生活质量，延长了患者的生存期；李氏等运用兰州方配合化疗治疗癌症10例疗效观察显示：近期疗效兰州方组优于单纯化疗组（p<0.05）；从毒副反应看，兰州方组明显轻于单纯化疗组（p<0.01）。裴氏升血颗粒与核素并用治疗肝癌15例，治疗组用核素加服裴氏升血颗粒（PG），对照组仅用核素，发现治疗组毒副作用明显轻于对照组，二者之疗效对比亦有显著性差异。

动物实验研究证明：裴氏升血颗粒能够显著抑制突变型p53以及提高Caspase-3的蛋白表达，提示该药可以通过下调突变型p53和上调Caspase-3的蛋白表达，诱导肿瘤细胞的凋亡，提示裴氏升血颗粒具有显著的抗肿瘤作用，抑制肿瘤的发生是裴氏升血颗粒抗肿瘤的重要分子机制之一。裴氏升血颗粒抑制NF-κB表达，影响基因转录功能，阻滞了肿瘤细胞G₁期向S期的进程，使得G₁期肿瘤细胞大量堆积；S期肿瘤细胞DNA合成和复制受到抑制和阻断，S期比率下降，细胞增生能力下降，从而抑制了肿瘤的生长增殖。裴氏升血颗粒可提高肿瘤细胞的凋亡率，具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用，提示裴氏升血颗粒具有显著的抗肿瘤作用。裴氏升血颗粒对荷瘤小鼠免疫器官胸腺、脾脏有明显增重作用，从而增强荷瘤小鼠特异性免疫功能。可促进ConA刺激的脾淋巴细胞增殖能力，增强荷瘤小鼠机体的细胞免疫功能，提高抗肿瘤效应。能够促进IL-2的分泌以及IL-2和IFN-γ mRNA的表达，提示裴氏升血颗粒可以通过对细胞因子的影响调节机体的免疫功能。裴氏升血颗粒能调节机体紊乱的免疫状态，可使荷瘤小鼠迟发过敏反应增强，增加荷瘤小鼠的细胞免疫功能。增强腹腔巨噬细胞吞噬功能，IL-1、IFN-γ、NO等细胞因子呈增高趋势；裴氏升血颗粒对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤有明显抑制作用。增强免疫功能是裴氏升血颗粒抗肿瘤的重要作用机制。裴氏升血颗粒可明显升高再障模型小鼠（经3.0GY直线加速器全身照射所建立）的外周血红蛋白、白细胞、血小板值，能明显恢复再障模型小鼠骨髓的造血功能。

小鼠脾脏病理组织切片观察显示，裴氏升血颗粒可减轻再障模型小鼠脾脏病理学改变，降低淋巴细胞的凋亡率，促进生发中心的恢复，使白髓面积扩大，被膜变薄，扩张的血窦基本恢复正常。免疫组化法检测脾脏CD4、CD8含量结果表明，裴氏升血颗粒可使再障模型小鼠脾脏CD4⁺含量呈增高趋势、CD8⁺含量呈降低趋势，增高CD4⁺/CD8⁺值，从而提高再障模型小鼠的免疫功能。

近年来，中药对机体的免疫调节和扶正抗癌作用已越来越受到人们的重视。肿瘤的存在不仅抑制机体的细胞免疫功能，同时也抑制体液免疫功能，而化疗药物的应用可以加重机体的免疫抑制。因此提高肿瘤患者的免疫功能，尤其是防治化疗后出现的免疫机能的严重抑制，成为抗肿瘤治疗的一个主要方面。因此，为进一步就裴氏升血颗粒对化疗药物抗肿瘤的增效减毒作用及其机制方面作研究，我们在上述研究的基础上采用小鼠H₂₂荷瘤模型，研究裴氏升血颗粒对H₂₂荷瘤小鼠5-Fu化疗后的增效减毒作用及其机制。通过观察不同剂量的PG合用5-Fu对小鼠H₂₂瘤体生长的情况，确定其抗肿瘤效果。从诱导肿瘤细胞凋亡角度研究PG的抗肿瘤机制，从蛋白、基因水平观察该药对H₂₂肿瘤细胞P27蛋白表达，从分子水平探讨裴氏升血颗粒的抗肿瘤诱导肿瘤细胞凋亡机理。为该药在治疗恶性肿瘤方面的应用，以及为中医和中西医结合治疗肿瘤提供科学依据，为裴氏升血颗粒临床广泛应用提供科学、微观的依据。

实验研究