2.5 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中VEGF的表达

2.5 采用免疫组织化学法检测肿瘤组织石蜡切片中VEGF的表达

末次给药24h后将小鼠称重，继而断颈处死，取肿瘤组织，用10%甲醛固定，脱水，用石蜡包埋。

2.5.1 制作石蜡切片

切片：将石蜡包埋的组织用病理切片机切成厚5μm石蜡切片。

脱蜡、水化：脱蜡前，将切片在45℃恒温箱中烘烤60min。切片置于二甲苯中浸泡20min，更换二甲苯后再浸泡20min，先后在无水乙醇中浸泡10min、95%乙醇中浸泡10min、90%乙醇中浸泡10min、85%乙醇中浸泡10min。

2.5.2 免疫组织化学染色（SP法）

1. PBS洗2~3次，各5min。
2. 滴加3%H₂O₂消除内源性过氧化物酶的活性，室温静置1015min。PBS洗23次，各5min。
3. 抗原修复：水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至92℃~95℃左右，放入切片加热15min，自然冷却。
4. 滴加正常山羊血清封闭液，室温15min，甩去多余液体。
5. 滴加I抗（兔抗鼠VEGF单克隆抗体），37℃孵育2小时左右。PBS冲洗，3min×3次。
6. 滴加生物素二抗工作液，37℃孵育15min。PBS冲洗，3min×3次。
7. 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min。PBS冲洗，3min×3次。
8. DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5~30min之间。蒸馏水洗涤。
9. 苏木精轻度复染。
10. 自来水冲洗中止反应。
11. 逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
12. 显微镜观察。

2.5.3 肿瘤组织VEGF阳性判断标准

VEGF阳性反应产物主要位于细胞质，细胞质染成棕黄色、棕褐色为VEGF阳性反应，否则为阴性。分别随机观察10个高倍镜视野，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为VEGF的阳性细胞数[20]。