关键词：方药研究 / 实验研究 / 配方资产 / 转化沟通 / 2.6.2 TNF-α浓度测定
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2.6.2 TNF-α浓度测定
严格按试剂盒说明操作。
试剂的配制： ① 提前30min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温。 ② 标准品的稀释：将冻干品管内加入1ml样品稀释液，彻底溶解后做倍比稀释。 ③ 生物素标记抗体工作液：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl生物素标记抗体加抗体稀释液990μl的比例配制。 ④ 亲和素-过氧化酶复合物(ABC)工作液的准备：根据每孔0.1ml计算总量，按10μl亲和素-过氧化酶复合物(ABC)加ABC稀释液990μl的比例配制。
操作步骤：
① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。
② 将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排8孔中，一孔只加样品稀释液作为对照，处理后的标本100μl每孔加入。
③ 用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。
④ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗板2次。
⑤ 将准备好的生物抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。用封板胶封住反应孔，37℃反应60min。
⑥ 0.01M TBS洗涤3次，每次浸泡1min左右。
⑦ 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。用封板胶封住反应孔，37℃反应30min。
⑧ 0.01M TBS洗涤5次，每次浸泡12min左右。
⑨ 按每孔0.09ml依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应，反应过程中，要经常的观察，当肉眼可见标准品的前34孔有明显梯度蓝色，后3~4孔差别不明显时，即可加入TMB终止液0.1ml/孔（显色反应最长不要超过30min）。用酶标仪在450nm测定OD值，根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。
2.7 ELISA法测定荷瘤小鼠血清IFN-γ的浓度
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