1 材料与方法

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂

• 10%甲醛（上海化学试剂公司）
• 盐酸酒精（上海化学试剂公司）
• 0.5% H₂O₂溶液（上海化学试剂公司）
• 1ml EDTA（乙二胺四乙酸）修复液（福建迈新生物技术开发有限公司）
• 兔抗鼠CD4、CD8单克隆抗体（长沙赢润生物制品有限公司）批号：GT200310

磷酸盐缓冲液（PBS）：氯化钠8.00g，十二水磷酸氢二钠2.885g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钾0.20g，三蒸水配制，0.22μm滤膜过滤除菌，pH 7.2~7.4，4℃保存。

1.1.2 实验仪器和设备

• 光学显微镜（Olympus BX60-F5）
• 直线加速器（德国西门子Primus）
• 三分类血分析仪（日本Sysmex KX-21）
• 三分类血分析仪（日本吉泰CA-800）
• 超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司VS-1300L型）
• 低温冰箱（青岛海尔股份有限公司BCD-213型）
• 脱水机（德国LEICA TP1020）
• 切片机（德国LEICA RM2135）
• 病理组织漂烘处理仪（常州中威电子仪器厂PHY-II型）
• 包埋机（常州中威电子仪器厂BMJ-I型）
• 染色仪（常州中威电子仪器厂CM1900HE）
• 电子天平（瑞士Sartorius公司BP211D型）

1.1.3 实验药品

裴氏升血颗粒（由生地、山萸肉、山药、丹皮、北沙参、人参须、潞党参、太子参、桂枝、浮小麦、大枣、麦冬、五味子、炙甘草、白芍、墓头回等组成，由甘肃省医学科学研究院制成颗粒冲剂，每包含生药量36.25g）

贞芪扶正颗粒（由佛慈制药有限公司提供，国药准字Z62020416）

1.1.4 实验动物

健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，体重（20±2）g，8~10周龄；DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周龄，由甘肃省医学科学研究院实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第14-009号。

1.1.5 胸腺淋巴结细胞悬液制备

取DBA/2小鼠断颈处死，用75%酒精浸泡5min，常规消毒后，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻剪碎、碾碎后，用200目尼龙网过滤，通过4号针头使其成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达95%以上。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型制备

1.2.1.1 动物分组

采用随机分组：

• 正常对照组：15只
• 再障模型组：60只（其中分裴氏升血颗粒大、中、小剂量组、模型组，每组各15只）
• 贞芪扶正颗粒对照组：15只

1.2.1.2 模型制备

参照姚军等再障造模，以及赵忻等关于免疫介导小鼠再障模型方法的改进，除正常组外，将其余75只BALB/C小鼠经直线加速器6MV γ射线全身照射，照射高度100cm，时间1分钟，剂量3.0Gy。照射4小时内经尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞悬液0.2ml，细胞数1×10⁶/只。造模一周后，经尾静脉采血，血分析结果表明，模型组与正常对照组比较，白细胞、血小板、血红蛋白均明显下降（P<0.01）。

骨髓涂片：造模一周后，每组随机取5只小鼠，脱颈处死后取出左侧股骨，用4号针头取1ml RPMI-1640液冲出骨髓滴于载玻片上推片，进行HE染色，在光学显微镜下进行骨髓组织形态学观察。结果显示模型小鼠骨髓涂片显示增生低下，粒系平均<15%、红系<7%、巨核细胞07个/Hp；正常组骨髓增生活跃，粒系平均>40%、红系平均>14%、巨核细胞4572个/Hp，两组比较有显著性差异（P<0.05）。以上结果证实本实验所复制的免疫介导型再障小鼠模型是成功的，可以按原方案进行后期实验。

表1 直线加速器γ射线对再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影响（x̄±S）

注：与正常组比较，#P<0.05，*P<0.01

1.2.1.3 给药方法

裴氏升血颗粒、贞芪扶正颗粒临用前分别用蒸馏水充分溶解，模型组给予等量生理盐水灌胃。根据文献中人/小鼠用药等效剂量换算法，中药中剂量组相当于成人临床用量的20倍，故裴氏升血颗粒大、中、小剂量组分别予以0.02g/g·d、0.01g/g·d和0.005g/g·d药液1ml（相当于成人用量的40倍、20倍、10倍）；给予贞芪扶正颗粒每只0.01g/g·d（相当于成人临床用量的20倍）1ml。各组均以普通饲料喂养，连续灌胃30天。

裴正学系列方药的研究

1.2.2 标本采集及处理

各组分别喂药20d、40d后分别两次尾静脉采血，将血分析结果进行统计；所有实验动物在实验结束后断颈处死，取脾脏，并以10%甲醛溶液固定标本，切片后HE染色，在光学显微镜下观察脾脏病理组织学改变。

2 免疫功能评价