2.5 采用免疫组化法检测肿瘤组织石蜡切片中P27蛋白的表达

2.5 采用免疫组化法检测肿瘤组织石蜡切片中P27蛋白的表达

2.5.1 制作石蜡切片

固定：肿瘤组织用10%甲醛固定。

脱水：脱水，用石蜡包埋。

切片：将石蜡包埋的组织用病理切片机切成厚5μm石蜡切片。

脱蜡、水化：脱蜡前，将切片在45℃恒温箱中烘烤60min。切片置于二甲苯中浸泡20min，更换二甲苯后再浸泡20min，先后在无水乙醇中浸泡10min，95%乙醇中浸泡10min，90%乙醇中浸泡10min，85%乙醇中浸泡10min。

2.5.2 免疫组织化学染色(SP法)

滴加3%H₂O₂，室温静置5~10min以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水洗3次。

热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲溶液(pH6.0)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃98℃起开始计时1520min，然后断离电炉，室温冷却2030min，PBS(pH7.27.6)液洗涤3min×3次。

滴加5%BSA封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。

滴加适当稀释的一抗(兔抗鼠P27单克隆抗体)，37℃1h左右。PBS(pH7.2~7.6)冲洗，3min×3次。

滴加生物素二抗工作液，37℃孵育20min。PBS冲洗3min×3次。

滴加试剂SABC，37℃孵育20min。PBS冲洗，5min×4次。

DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5~30min之间。蒸馏水洗涤。

苏木素轻度复染。

自来水冲洗中止反应。

逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

显微镜观察。

2.5.3 P27蛋白阳性判断标准

P27蛋白阳性反应产物主要位于胞核/胞浆。胞核/胞浆染成棕黄色、棕褐色颗粒为P27阳性反应。分别随机观察10个高倍镜视野，计算每个高倍镜视野100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为P27的阳性细胞数。