2.5 ELISA法测定IL-2浓度

2.5 ELISA法测定IL-2浓度

IL-2的诱生： 取上述制备的脾淋巴细胞悬液，加入48孔板中，每孔0.9ml，同时每孔加入含ConA的1640培养液100μl（ConA的终浓度为5μg/ml），置37℃含5%CO₂的培养箱中培养36h[28]，收集上清液（即IL-2）。

IL-2浓度测定： 按试剂盒说明操作[29]。

试剂的配制：

1. 提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡室温
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:20）
3. 标准品： 加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置15分钟混匀（2000pg/ml），根据标准曲线所需浓度再作稀释（标准曲线浓度为：7.8、15.625、31.25、62.5、125、250pg/ml）
4. 生物素化抗体工作液： 以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体（1:100）
5. 酶结合物工作液： 以酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物（1:50）

裴正学系列方药的研究

1.0 操作步骤

① 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。

② 除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（100μl/孔）加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。

③ 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

④ 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液（100μl/孔）。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。

⑤ 洗板5次。

⑥ 除空白孔外，酶结合物工作液（100μl/孔）。用封板胶封住反应孔，37℃孵箱孵育30min。

⑦ 洗板5次。

⑧ 加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育15~20min。加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值（5min内）。

2.6 RT-PCR法测定脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ mRNA的表达水平

RT-PCR实验用具的处理：将所需离心管、PCR反应管、吸头等用0.1%的DEPC溶液浸泡24h后，超净台内风干备用。