2.6 NF-κB检测

2.6 NF-κB检测

2.6.1 制备单细胞悬液

在无菌条件下，取新鲜瘤组织0.5cm³，放入平皿中，用磷酸缓冲液（PBS）除去瘤组织表面的血液及血凝块，加入少量PBS；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1000r/min，5min。再用PBS液洗三次，每次以800r/min的低速离心5min除细胞碎片；以350目尼龙网过滤去除细胞团块，做细胞计数并调整细胞浓度为2×10⁶/ml。

2.6.2 固定透膜

将单细胞悬液分为2管（对照管和分析管），在已制备好的单细胞悬液中加入100μl固定剂Intraprep Reagent I进行细胞固定，用力振匀，室温下放置15min，加入适量PBS液混匀后，室温下1200r/min离心5min，反复2~3次，弃上清液。再在两个试管中加入Intraprep Reagent II透膜剂100μl，振匀后室温下放置15min。

2.6.3 单抗结合

在分析试管中，加入20μl的I抗（1:50，NF-κB p65），对照管中加入20μl的PBS缓冲液，两管轻轻摇匀后，室温孵育30min，再在两管中加入适量PBS液，室温1200r/min离心5min，反复2~3次，弃上清，同时加入20μl II抗，室温孵育30min，进行反应。

2.6.4 准备上样

两管中加入适量PBS液，充分振匀后，室温下1200r/min离心5min，反复2~3次，弃上清液，加入500μl含0.5%甲醛的PBS液后，准备上机检测[22-24]。